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HepaRG细胞的生物学特点及其应用

肝脏不仅是外源化合物吸收、消化、代谢的场所,也是体内一些必需物质的吸收、贮存、代谢的器官。由于外源性化合物体内代谢过程中可致肝脏损伤,因此肝脏也是毒理学研究的主要器官之一。

因遗传、环境及病理生理的不同,外源性化合物在不同种属和同一种属的不同个体间的代谢存在差异,故以动物试验来验证药物的肝毒性有时会出现与人体内迥异的状况,需寻找适合于体外肝毒性研究的体外肝细胞模型。为模拟人体内的-肝脏的代谢途径和毒性机制,常采用人原代肝细胞,因其在一定条件下还具有体内肝细胞的一些功能及活性,特别是还保留有药物代谢中的I相药酶(CYP)活性,具有研究价值。而人胎肝细胞只能表达微量的CYP1A1和CYP3A7。此外,来源于人的肝肿瘤细胞株,如HepG2,具有肝细胞的一些基本功能,如含有CYP450的一些酶(如CYP2E1、1A1等),也可用于CYP诱导、基因的表达及药物代谢机理的研究。然而,人原代肝细胞来源稀少,生命周期和生长活性有限,即使改进培养方法,采用三明治夹心培养法,都会随培养时间增加,难以维持和体内一致的CYP酶系,使肝细胞对受试物的反应能力迅速下降。此外,人肝细胞虽可长期冻存,但冻存复苏后的肝标志性的生物学活性会受到影响。HepaG2缺乏肝标志性的生物学活性,CYP相关酶系诱导表达量少,即使采取质粒转染CYP酶或肝特异性转录因子的方式,转染的细胞株也不适合研究正常肝细胞的基因表达调控。

尽管原代人肝细胞在运用中受限颇多,但它仍然是体外研究化合物代谢和药物毒性的细胞模型的金标准。人肝细胞株——HepaRG细胞,是从慢性丙型肝炎病毒感染的肝癌患者体内非瘤组织分离而得的细胞株,能表现人肝细胞的大多数功能,包括药物代谢所涉及的主要CYP酶系。本文对HepaRG细胞的生长形态、与药物代谢、毒理学相关的特性和应用综述如下:

一、生长形态学特性

HepaRG细胞有其独特生物学特性:低密度接种时(2.6x104个细胞/cm2),起初表现为狭长的未分化形态,1周内缓慢融合,积极分化形成两种不同形态学特征的细胞:一种为准肝细胞样的粒状上皮细胞,另一种仍为扁平的胞质透明细胞包围前者。可进一步分化为明显的肝细胞形态和胆管样结构。未分化的狭长HepaRG细胞能表达肝祖细胞的标志,而分化的两种类型细胞能分别表达肝细胞和胆管细胞的生物学标志,其中,肝样细胞占50%~55%的增殖水平。这种从同一祖细胞向肝细胞样和胆管样两种细胞类型分化的特性及其罕见,与既往报道的肝瘤细胞株大不相同,和25年前用肝细胞和未分化胆管细胞共培养所建立的细胞模型有些相似,且能更长更好的保持肝细胞的肝特异性功能特性。然而,当分化的肝样细胞高密度接种时(0.45x106个细胞/ cm2),他们的增殖活性反而有限,但能保持肝样细胞特点。

当HepaRG细胞从祖细胞开始活跃增殖时,白蛋白及触珠蛋白mRNA表达极其低下,随着细胞融合分化后逐渐增加。当高分化为肝样细胞后,成熟肝细胞的标志——醛缩酶B mRNA的水平,达到新鲜分离的人肝细胞20%的水平。相比HepaG2细胞,其白蛋白和触珠蛋白mRNA的表达水平比HepaRG细胞低,检测不到醛缩酶B的转录。

图1:HepaRG细胞的分化过程

图2:终末分化的HepaRG细胞

图3:HepaRG细胞的的分化和转分化

二、药物代谢相关酶系

细胞色素P450(CYP)是最大的药物代谢酶蛋白超家族之一,其中参与人体肝药物代谢的主要有CYP1、CYP2、CYP3及CYP4家族。P450酶易受多种内外源性物质的诱导或抑制,导致酶数量和活性改变,从而改变药代动力学,使药物活性物质累积导致毒性增强或降低其血药浓度和治疗效果。在如何提高药物疗效和降低毒副反应的临床研究中颇为重要。

HepaRG细胞与HepG2细胞及人原代肝细胞最大的区别在于:HepG2细胞没有CYP2B6,2C9,2E1和3A4的转录表达,而当培养的HepaRG细胞开始融合,加入DMSO后,就能表达CYP1A2、2B6、2C9、2E1和3A4。在HepaRG细胞处于分化的大多阶段,其表达的CYPs能与原代人肝细胞培养相媲美。对DMSO最为敏感的是CYP2B6、2E1和3A4。无论是HepaRG细胞还是原代人肝细胞要想CYP2C9高水平表达,均需对培养基加入CYP2C9的诱导剂——糖皮质激素。研究人员对与外源性物质代谢相关的CYP,如CYP1A1/2、CYP2A6、CYP2B6、CYP2C8、CYP2C9、CYP2C19、CYP2D6和CYP2E1,在HepaRG细胞和原代人肝细胞中进行了检测,发现HepaRG细胞和原代人肝细胞对CYP的选择性诱导和抑制活性表达基本一致,除CYP2A6和CYP2E1。但鉴于CYP2A6和CYP2E1并非药物代谢中常用的主要的催化剂,因此,HepaRG细胞仍不失为能替代人原代肝细胞研究药物代谢的体外细胞模型。

图4:微量DMSO促进HepaRG分化

CYP3A酶在体内含量很高,于肝脏和小肠中都有分布,其底物相当广泛,包括内源性甾体激素、胆汁酸以及50%的临床常用药物。既往认为,体外培养的肝细胞中,只有人原代肝细胞才与CYP3A4相关。现在发现,培养的HepaRG细胞加入DMSO后也可诱导CYP3A4表达量,且表达量不受利福平影响。HepaRG非常趋近于人原代肝细胞,可进行不同诱导剂诱导CYP3A酶表达量的研究。在HepG2细胞中,只有利福平这样的强诱导剂才能诱导CYP3A4的微量表达。HepG2细胞由于下调PXR和CAR的表达,因此使CYP3A4的含量低于人肝细胞和HepaRG细胞10-100倍。同时PXR和CYP3A4的表达,在HepaRG细胞和人原代肝细胞,都能通过脂多糖受到抑制。

图5: HepaRG细胞各项生理生化指标检测

药物代谢还需II相药酶的参与。HepaRG细胞中,II相药酶,如谷胱甘肽转移酶GSTA1/A2,GSTA4,GSTM1和尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基(UGT)1A1的mRNAs水平通过PT-qPCR检测都高于HepG2,即使在分化的HepaRG细胞,II相药酶也维持有很好的表达水平。

鉴于肿瘤细胞在缺氧微环境下常得以存活并使肿瘤的恶性程度进一步增强,它还能引发肿瘤对放/化疗的耐受,科学家利用HepaRG细胞,模拟人体HCC低氧条件下,研究药物代谢酶的表达与氧含量条件下的差异。认为HepaRG细胞不仅具有药物代谢相关的酶系,还能充当化疗药物测试的良好细胞模型。

图6:非酒精性脂肪性肝疾病模型

图7药物引起的脂肪变性疾病模型

三、参与毒理学研究

药物毒性研究是药物研究的重要组成部分。药物通过肝脏代谢后,大多数药物的毒性被消除,但也有一些无毒或低毒的物质通过生物转化后反而有毒甚至毒性加倍,因此肝脏必然成为研究药物毒性的重要靶器官,而肝细胞培养也用于毒理学研究的诸多方面。

图8: HepaRG肝毒性检测

由于HepG2细胞缺乏大多数CYP酶系,对一定肝毒性的化学物不敏感,因此,胺碘酮和氯丙嗪这类不需要代谢也能诱导肝毒性的药物在HepaRG细胞和HepG2细胞中都会显示毒性。而对比醋胺酚和黄曲霉素B1这类需要生物转化才能显示出毒性的化学物,在分化的HepaRG细胞中更显示其细胞毒性。因为黄曲霉素B1,其毒性是通过CYP1A2和3A4的代谢物8,9-环氧化物造成的,当黄曲霉素B1半抑制浓度(IC50)为5LM于24h后,在HepaRG细胞中的毒性与原代人肝细胞中发现的状况吻合,对比在HepG2细胞中,即使IC50达到100LM,也无法发挥毒性。这些研究说明结合细胞功能和细胞毒性的研究方法来研究药物肝脏毒性的机制时,通过在HepaRG细胞中检测结构相关的化合物,使HepaRG细胞可作为研究肝毒性的细胞筛选模型。

图9: HepaRG 的ADME应用

研究人员用安全、可重复性好的cDNA microarrays微序列技术来评估苯巴比妥作用HepaRG细胞后,基因表达的变化,模拟了人肝细胞在氧化刺激、炎症反应及凋亡时CYP及膜转运蛋白的表达。另外他们还发现,苯巴比妥对HepaRG细胞的毒性呈剂量、时间依赖性。在HepaRG细胞内检测CYP1A2、2B6、2E1和3A4,还有一些II相药酶、抗氧化酶、膜转运蛋白、PXR、CAR及醛缩酶B等转录的稳定性至少4周,认为HepaRG细胞能作为观察药物急慢性化学毒性和遗传毒性的体外细胞模型。

图10:全转录组分析

四、HepaRG细胞的运用

最早研究报道HepaRG细胞可感染HBV,随后关于HepaRG细胞用于HBV研究的报道相继发表。而后研究人员运用蛋白组学的方法也予以证实。还基于HBV前S1区衍生而得的合成肽段阻止HBV进入HepaRG细胞感染,认为HepaRG有利于研究嗜肝病毒感染细胞的分子机制。研究人员用HepaRG细胞感染HBV,发现分化为肝细胞样的HepaRG细胞能持续感染HBV达100d之久。HBV在HepaRG细胞的感染过程似乎很缓慢,病毒复制开始于感染后第8d,13d达高峰,有陆续的cDNA的合成。拉米夫定能阻止病毒复制,但不能阻止病毒感染和cccDNA合成。此外,体内移植表明,HepaRG细胞对裸鼠未显示明显的致瘤性。移植到Alb-uPA/SCID小鼠体内,仍然保持了分化功能,并具有成熟肝细胞的生物学特性。

图11: HepaRG的HBV感染

综上所述,HepaRG是具有独特生物学特性的人肝细胞株。不但能表达正常肝细胞相关的I相和II相药代酶,在体外研究药物代谢和毒性机制中发挥作用,而且还能感染HBV,可用于体外肝炎病毒分子机制的研究,很有希望成为原代人肝细胞的替代物。同时,HepaRG细胞相比原代人肝细胞,还具有异于后者的优势:①从同一细胞株来源的无论是分化还是未分化的细胞,都可用作体外细胞模型;②各种异生物的代谢酶的活性能够被定量诱导接近于不同个体差异的表达水平,这样就有利于提供不同差异个体药物代谢和遗传毒性的研究;③功能活性在3~4周细胞融合后还相对稳定维持1~2周,证明其可用于慢性毒性的研究;④在分化的HepaRG细胞中,可用于化合物肝毒性的检测。待HepaRG细胞增殖以后,还可用于致突变检测,可作为人类潜在致癌物检测的工具;⑤HepaRG可以冻存而不丧失正常肝细胞的特异性的生物学功能。

图12: HepaRG的应用领域