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iPS工具帮你逆转细胞的时钟

自山中伸弥诱导出第一个iPSC(诱导多能干细胞)以来,已经过去了七年。2012年,这一成果为他赢得了2012年的诺贝尔生理/医学奖。 

人们一般通过诱导一些转录因子(最常用的是Oct4、Klf4、Sox2、c-Myc或OKSM),将已分化的细胞转化为iPSC。这一技术已经渗透到了生命科学的各个领域,研究者们在此基础上寻找致病基因、进行药物研发和开发细胞疗法。Stemgent为您提供iPSC全套工具,可以大大简化和促进iPS过程。

运载工具 

山中伸弥最初是利用逆转录病毒载体,对细胞进行重编程。如今,商业化的逆转录病毒编程载体已经非常常见。

一些研究者担心转基因会在宿主基因组引起意外改变,希望在重编程中避免基因的整合。此外,有些重编程因子可能致癌。如果要将细胞用于临床,基因整合肯定是不可行的。

事实上,Stemgent早就正式推出了iPS重编程系列试剂盒(Stemgent® MicroRNA-Enhanced mRNA Reprogramming System)。只需2周即可将靶细胞重编程为iPS细胞,与仙台病毒(Sendai Virus)、非整合型DNA载体(Episomal DNA Vectors)等传统iPS重编程方法相比,缩短实验周期超过50% 以上。

与病毒、DNA载体依赖的iPS重编程手段不同,使用Stemgent®MicroRNA-Enhanced mRNA Reprogramming System对靶细胞进行重编程,生成的iPS细胞无需进行复杂耗时的下游筛选程序,只需简单几个步骤,即可轻松构建iPS细胞系。

病毒、DNA载体等依赖的iPS重编程技术,其重编程效率介于0.00001%到1%之间不等,而Stemgent® MicroRNA-Enhanced mRNA Reprogramming System的重编程效率远远大于1%,极大地提高了iPS克隆的产出率。

某些iPS研究领域,例如iPS临床研究、治疗应用等,对iPS细胞的安全性提出了极高的要求。使用Stemgent® MicroRNA-Enhanced mRNA Reprogramming System重编程靶细胞,无需担心构建的iPS细胞系可能含有病毒载体残留,亦无需担心无关的基因整合进宿主基因组,是目前适用于临床研究及治疗的最理想选择。

而以仙台病毒(Sendai Virus)为载体的iPS重编程手段,其病毒基因组虽然不会整合进宿主染色体,仙台病毒本身也不具备复制能力,但是为了构建真正意义上的virus-free的iPS细胞系,通常需要经过一个10-20代、耗时费力的筛选过程,以确保最终得到的iPS细胞系无病毒载体残留。以慢病毒(Lentivirus)体的iPS重编程手段,病毒基因组能够永久整合进宿主基因组,会给后续的iPS细胞分析带来干扰。

以仙台病毒为载体的iPS重编程试剂盒非常昂贵,综合重编程效率、时间及劳动力成本、安全性等多重考虑,Stemgent®MicroRNA-Enhanced mRNA Reprogramming System无疑是性价比的上乘之选。

Stemgent公司提供的重编程试剂,以合成的mRNA为基础。这一产品的优势在于,既不是病毒载体,也不整合到基因组,Stemgent公司的研发主管Brad Hamilton介绍到。但是,由于细胞无法保留这些RNA,需要通过转染反复将其引入细胞。不过,现在公司已经大大简化了这一过程。 

Stemgent公司的新miRNA Booster技术,利用microRNA对mRNA的效果进行补充。这些microRNA能够上调多能性因子,下调分化性因子。这一技术大大简少了整个重编程系统所需的转染步骤。“我们以miRNA、Stemfect™RNA转染试剂盒、(BD)Matrigel™为基础,建立了新的重编程方案,能够减少日常工作量,降低转染次数,节约时间,生成无需整合的人类iPS细胞克隆。

小分子可以帮你提高细胞重编程的效率,Stemgent公司为您提供Stemolecule™ 系列小分子产品。这些分子主要负责打开染色质,不过有时它们也能够替代特定的重编程因子。举例来说,Stemgent公司的Stemolecule™ ALK5 Inhibito就能够取代Sox2。Stemolecule™ ALK5 Inhibitor是TGF-β 家族I 型受体ALK5的ATP竞争性抑制剂。TGF-β信号的抑制增加重大鼠肝细胞和IMR90人成纤维细胞编程为类似小鼠胚胎干细胞的iPS的效率,并在传代30代之后仍能维持细胞的未分化状态。小鼠胚胎干细胞培养条件与TGF-β信号失活相结合,提供健全的培养大鼠和人iPS细胞重编程为iPS的方法。 这些研究表明TGF-β既能调节胚胎干细胞的细胞命运,并且提供一个新的培养大鼠和人iPS细胞的方法。 

在通常情况下,细胞重编程至少需要一个转录因子。不过今年夏天,北京大学的研究人员首次展示,只需要七种小分子就可以生成小鼠的iPSC(他们将其称为CiPS),整个系统无需核酸参与。

 

培养基 

胚胎干细胞需要在特定的培养基上生长,iPSC也同样如此。

Stemgent公司的NutriStem™ 生长培养基和Pluriton™重编程培养基。据Hamilton介绍,NutriStem和Pluriton高度兼容,能够有效地从细胞重编程过渡到细胞扩增。 

Stemedia™NutriStem™XF/FF培养基是一种成分明确、无异源性、低生长因子、非饲养层依赖的人胚胎干细胞/诱导多能干细胞培养基,适用于多能干细胞培养及扩增。经过研发人员反复优化及测试,使用Stemedia™NutriStem™XF/FF培养基培养多能干细胞至少20代仍能维持其多能性Marker表达及正常染色体组型,并且能够在体外分化成三个胚层所有的细胞类型。Stemedia™NutriStem™XF/FF培养基能够为细胞提供了一个完全无异源性的生长环境,且无需添加高浓度的的碱性成纤维生长因子以及其他一些刺激性的生长或细胞因子。此外,使用Stemedia™NutriStem™XF/FF培养基,细胞附着、扩增能力显著优于其他培养基,尤其适用于高通量筛选。

鉴定工具 

据Hilcove介绍,人们一般通过两种途径鉴定自己得到的iPSC。一是染色体核型分析,用来检测染色体异常。二是细胞分化,验证iPSC是否能够形成所有三种胚层(外胚层、内胚层和中胚层)。传统上,人们利用小鼠畸胎瘤分析来确定细胞的分化能力,但近来研究者们越来越倾向于使用体外的细胞分化系统,一旦细胞完成分化,人们就能够通过抗体或基因表达分析,检验各细胞胚层的标志物。

除了细胞的分化情况以外,研究者们也可以用抗体检验细胞的多能性。Stemgent推出了自己的抗体产品,针对细胞的多能性或分化性,靶标细胞表面或细胞内的各种标志物。这类产品形式多样,应用广泛,可用于流式细胞分析和免疫荧光分析。 Stemgent公司的抗体既可以靶标转录因子(Nanog、Oct4A、Sox2),也能靶标细胞表面的标志物(SSEA4、TRA-1-60、TRA-1-81)。

用于活细胞的iPSC检测工具,也受到了研究者们的青睐。Stemgent公司的StainAlive™荧光标记抗体适用于活细胞。Hamilton解释道:“在体外培养的细胞中,这些抗体可以帮助人们标记目标克隆。24-48小时后,抗体的信号会慢慢褪去。”