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Alvetex 3D细胞培养支架

什么是Alvetex®支架?

Alvetex® 系列产品是特别针对三维细胞培养设计的高度孔隙化(成孔率>90%),由惰性聚苯乙烯制成,厚度为200µm,孔径约为36-40µm的圆盘状(Disc)支架。

Fig 1. 扫描电镜(SEM)下观察到的Alvetex®支架微观结构
 

Fig 2. Alvetex®三维细胞培养支架系列产品类型一览:Well insert (6-well, 12-well);Well plate (12-well, 24-well, 96-well, 384-well);Well insert + Well insert holder in deep Petri-dish;Well insert + Perfusion plate.

 

 

为什么选择Alvetex®三维细胞培养支架?

Alvetex®支架为细胞生长提供了一个模拟体内生理条件的绝佳模型,细胞一旦接种到Alvetex®支架,即很容易进入到支架孔隙内并开始生长。所培养细胞在形态、细胞行为、反应特性方面都更接近于体内天然生长细胞。

Figure 3. 传统2D培养体系与Alvetex®三维细胞培养支架培养的成纤维细胞结构(细胞骨架、细胞核)对比。与传统的二维培养相比,三维条件下培养的细胞,细胞形态更生动立体,更接近体内自然状态。

 

Figure 4. Alvetex®系列三维细胞培养支架培养的4种不同来源的肝细胞。培养细胞经Bouin’s溶液固定、石蜡包埋后切片(10 µm),经两种染料——苏木精和伊红复染后置于光学显微镜下观察。(A)Alvetex® 6-well insert(AVP004)培养的HepG2细胞系(ATCC, HB-8065),40x物镜;(B)Alvetex® 24-well plate(AVP006)培养的Upcyte®肝细胞(Medicyte GmbH), 20x物镜;(C)Alvetex® 12-well plate(AVP006)培养的冻存大鼠肝细胞(Biopredic Int.),40x物镜;(D) Alvetex® 12-well insert(AVP005)培养的大鼠肝细胞(Abcellute Ltd.), 40x物镜;

 

Figure 5. 与传统2D培养体系相比,Alvetex®三维培养支架培养的HepG2细胞系表现出极佳的生长状态:细胞均一性提升,细胞间相互连接紧密度增加,并且开始形成较为复杂的细胞结构如微绒毛(microvilli)等。(A)HepG2细胞系在传统2D培养体系下培养7天的扫描电镜图片;(B)扫描电镜下观察到的于Alvetex® 三维培养支架内培养7天的HepG2细胞系;(C)高倍投射电镜下观察到的使用Alvetex®三维培养支架培养21天的HepG2细胞系,可以观察到微绒毛(microvill)、紧密连接(tight junctions)以及胆小管样结构(bile canaliculi-like structures)。

 

Figure 6. (左图)使用Alvetex®三维培养支架培养的HepG2细胞系,其细胞活性(MTT法检测)及分泌进入培养基的白蛋白(Albumin)水平显著高于传统2D模式下培养的HepG2细胞。(右图)以不同的接种密度(8x, 32x, and 64x 104 cells per well)将大鼠原代肝细胞接种于Alvetex®三维培养支架内培养24小时,使用钙黄绿素乙酰基甲基酯(calcein AM)/溴化乙锭(ethidium)异源二聚体标记法测定细胞活力,生长于Alvetex®三维培养支架内的原代肝细胞活性亦显著高于2D模式。

 

Figure 7. 与传统2D培养方式相比,Alvetex®三维培养支架培养的大鼠原代肝细胞在培养48h、72h后诱导产生不同亚型细胞色素氧化酶P450(CYP, CYP-1A2,CYP-2B1,CYP-3A2)的能力显著提升。

 

 

Alvetex®3D细胞培养支架操作流程

一、预处理

首先将Alvetex®支架完全浸没于70%酒精内润洗1次,吸弃酒精,PBS润洗支架2次。为了防止支架风干,请将支架浸没于第二次润洗时使用的PBS内,直至需要。

二、包被

为促进细胞粘着,选择合适的coating solution (poly-D or L-lysine,Fibronectin,Collagen I等)包被Alvetex®支架。以poly-D or L-lysine包被为例:吸弃PBS,加入poly-D or L-lysine,500/Well,盖好盖子,室温孵育1小时;

三、接种

将待培养细胞重悬于少量培养基内制成细胞悬液,吸弃培养板内多余的coating solution,然后小心地将细胞悬液转移接种至Alvetex®支架内,为保证最佳培养效果,请将细胞接种至支架最中央的位置。不同规格Alvetex®支架推荐接种密度及接种体积详见表1。

四、孵育

接种完毕后,将培养板的盖子盖上,放置于37℃,5% CO2培养箱内孵育至少30分钟以促进细胞附着到支架上。不同规格Alvetex®支架推荐孵育时间详见表1。

表1. 不同规格Alvetex®支架推荐接种密度、接种体积以及孵育时间

 

五、培养

孵育结束后,根据所培养的细胞类型、代谢活力等需求不同,轻轻地往培养板的每一个Well里面加入适量的培养基,然后再次置于37℃,5% CO2培养箱内孵育一段时间后,首次换液,之后每隔2-3天换液(据所培养的细胞类型、代谢活力等需求不同,首次换液时间以及换液频率有所不同)。不同规格Alvetex®支架推荐添加的培养基用量详见表2。

 

 

六、下游分析

传统2D培养模式下用于分析、检测的标准细胞及分子生物学方法如显微成像、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫荧光、细胞活力检测、蛋白质组学/基因组学定量分析等,同样适用于Alvetex®3D细胞培养支架培养的细胞。

Figure 8. A. CHO-K1细胞分别以0 cells, 0.5 million cells和2 million cells/支架的接种密度接种于Alvetex®支架(AVP002),培养24h后,使用无毒性的0.5 % 中性红染料(Sigma, N6264-50ML)染色并置于显微镜(明场)下观察;B. 人角质化细胞系(HaCaT)于Alvetex®支架培养7天,固定、石蜡包埋、切片后通过免疫荧光技术进行分析:phase contrast (top), blue fluorescent Hoescht 33258 nuclei stain (middle),Ki67 staining (bottom).

 

 

Figure 9. GFP转染的CHO-K1细胞于Alvetex® 支架(AVP004)培养6天,激光共聚焦显微镜下观察到的单一的GFP转染CHO-K1细胞为期3个小时的细胞行为变化:获取图像间隔30min。

 

Figure 10. HepG2细胞系于Alvetex® 支架(AVP002)培养3天后,分别进行Hoechst 33342 (blue), cytokeratin 8 (green) 和Nile Red (red)标记并在激光共聚焦显微镜下观察。

 

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